Dénombrement des coliformes totaux par comptage des colonies à 30°C

1- Référence :

Méthode de routine NF V 08-050

2- Principe

Ensemencement en profondeur du milieu gélosé à la bile, au rouge neutre, au violet cristal et au lactose (VRBL), coulé dans une boîte de Pétri, avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité déterminée de la suspension mère dans le cas d’autres produits. Recouvrement avec une couche du même milieu.

Dans les même conditions, ensemencement d’autres boîtes avec les dilutions décimales obtenues à partir de l’échantillon pour essai ou de la suspension mère.

Incubation des boîtes à 30°C pendant 24 h ± 2h

A partir du nombre de colonies caractéristiques dénombrées par boîte de Pétri, calcul du nombre de coliformes par millilitre ou par gramme d’échantillon pour essai.

3- Appareillage :

- Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four)

- Appareil pour la stérilisation en chaleur humide (Autoclave)

- Etuve, réglable à 30°C ± 1°C

- Boîtes de Pétri stériles de diamètre 90 mm ou 140 mm

- Bain thermostaté réglable à 47°C ± 2°C

- Tubes à essai et flacons de capacité appropriée

- Propipette de capacité nominales de 1ml

- Pipette paille de 1 ml

- pH- mètre, précis de 0,001 unité pH

-Stomacher

-Compteur colonie

-Postes de sécurité microbiologiques

-Brûleurs à gaz

4- Réactifs :

- Eau Peptonée Tamponnée (EPT)

- Gélose au cristal violet, au rouge neutre, à la bile et au lactose (VRBL)

5- Méthode :

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6- Expression des résultats :

* Cas général :

Où :

Σ C : est la somme des colonies comptées sur les boîtes retenues de deux dilutions successives.

V : est le volume de l’inoculum applique à chaque boîte, en millilitres

n1 : est nombre des boîtes retenues à la première dilution

n2 : est nombre des boîtes retenues à la seconde dilution

d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

* Estimation des petits nombres :

1- Si la boîte, au niveau de l’échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension –mère (autres produits) ou de la première dilution ensemencée ou retenue, contient moins de 15 colonies, on calcule le nombre estimé Ne

Ne = C/Vxd

C : est le nombre de colonies caractéristiques comptées.

V : est le volume de l’inoculum applique à la boîte, en millilitres

d : est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

1- Si la boîte , au niveau de l’échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension –mère (autres produits) ou de la première dilution ensemencée ou retenue , ne contient aucune colonie , le résultat est exprimé comme suit :

Moins de 1/vd microorganismes par millilitre essai (produits liquides) ou par gramme(autres produits).

d : est le taux de dilution de la suspension-mére ou la première dilution ensemencée ou retenue ;

Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs.